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利用多酚/蛋白互作模型研究多酚对葡萄酒涩感的影响

发布人:杜康集团 来源:杜康集团 www.erwyyv.tw更新日期: 2018-12-08 05:53:32

利用多酚/蛋白互作模型研究多酚对葡萄酒涩感的影响

涩感是葡萄酒最重要的感官质量之一,普遍的观点认为是葡萄酒多酚与唾液蛋白相互作用,使得唾液的润滑度降低,口腔内的摩擦系数增大,进而引起涩感[1]。而涩感的研究除感官评价外,多酚/蛋白的相互作用的机制的研究是?#32654;?#30740;究的基础。许多研究结果显示:多酚/蛋白的相互作用不仅与多酚的含量有关,与酚类物质的结构(糖苷化,?#33108;?#21270;,甲基化,立体异构化,聚合度?#23663;?#20998;异构化等)也有很大关系[2~6]。不同的葡萄品种、气候条件和酿造工艺导致在静置以及其他过程中浸入酒中的酚类物质的种类、含量存在差异[7,8]。国内外关于葡萄酒酚类物质的研究集中在总酚的含量、总酚与涩感的相关性,也有一部分研究没食子酸和儿茶素等单体酚?#27169;?#20294;研究不同聚合度多酚与涩感的关系的却不多。

葡萄酒中影响涩感的物质主要是酚类物质,而酚类物质很多都以复合态或聚合态存在,分子质量大且结构复杂,因?#26494;?#20837;研究不同聚合度的多酚对涩感的影响对剖析葡萄酒的涩感有重要意义。而不同聚合度的多酚的对涩感的影响程度不同。选择不同品种的葡萄酒,根据极性将酚类物质分为不同聚合度的单体酚、低聚物(mDP=2~12-15)[9,10]、高聚物(mDP=12-15~32-34)[9,10]三个部分,利用多酚/蛋白互作模型研究其对涩感的影响,?#20113;?#30830;定影响涩感的关键组分及其与涩感的相关性。

葡萄酒中的酚类物质的种类、含?#24247;?#24433;响着涩感,而不同工艺、不同品种的葡萄酒的涩感差异明显[11],因此研究不同聚合度的酚类物质对涩感的影响至关重要,通过建立体外多酚/蛋白互作模型研究不同红酒中多酚及其不同聚合度的多酚成分对涩感的影响,为葡萄品种选育和葡萄酒酿造工艺改良等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理


1.1.1 实验样品

莫高干红葡萄酒(R1),长城干红葡萄酒(R2),师原赤霞珠干红葡萄酒(R3),赤霞珠单品种葡萄酒(R4),蛇龙珠单品种葡萄酒(R5),美乐单品种葡萄酒(R6),佳美单品种葡萄酒(R7),神索单品种葡萄酒(R8)。

1.1.2 样品处理

C18固相萃取小柱处理:10 mL的甲醇洗?#40486;?#21270;后,用20 mL的蒸馏水?#30784;?#27969;速0.5 mL/min[12,13]。

葡萄酒中单体酚的分离?#33322;?0 mL酒样加入C18固相萃取柱。以 10 mL的蒸馏水洗脱,流速 0.5 mL/min。将洗脱部?#36136;?#38598;起来并以60 ℃旋转蒸干后,用模拟酒样缓冲液溶解并定容到5 mL棕色容量瓶中[14~16]。

葡萄酒中低聚物的分离?#33322;?5 mL乙酸乙酯加入C18固相萃取柱,进行洗脱,流速0.5 mL/min。将洗脱部?#36136;?#38598;起来并以45 ℃旋转蒸干后,用模拟酒样缓冲液溶解并定容到5 mL棕色容量瓶中[14~16]。

葡萄酒中高聚物的分离?#33322;?5 mL甲醇加入C18固相萃取柱,进行洗脱,流速0.5 mL/min。将洗脱部?#36136;?#38598;起来并以40 ℃旋转蒸干后,用模拟酒样缓冲液溶解并定容到5 mL棕色容量瓶中[14~16]。

1.1.3 实验试剂

丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N’N’-四甲基乙二胺(TEMED)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、过硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、谷氨酸、考马斯亮蓝 R250、G250,美国 Sigma公司;丙三醇、浓盐酸、甲醇(分析纯)、冰乙酸,天津天力。

1.2 实验方法


1.2.1 总酚和总黄烷醇的测定

本试验采用福林消卡法(F-C)测定总酚,测定结果以没食子酸计[17]。将待测的成品酒样10 μL稀释10倍至100 μL,加入到10 mL的试管中,然后加入7 mL的水,振荡摇匀,在加入0.5 mL的福林酚试剂,充分振荡摇匀,静置1 min后,加20%的Na2CO3溶液1.5 mL,振荡混匀后加0.9 mL水,最后在暗处避光反应60 min,于765 nm处测定吸光值,每个处理平行重复两次,最后以没食子酸的等价?#23548;啤?#27809;食子酸标准溶液浓度为:0 mg/L、50 mg/L、l00 mg/L,150 mg/L、250 mg/L和500 mg/L。红葡萄酒酒样稀释10倍;白葡萄酒样品不稀释[18]。

采用DMACA法测定总黄烷醇,结果以儿茶酚计[8]。将 5 μL 成品酒样稀释 20 倍至 100 μL,加入 10 mL试管中,加入0.1% DMACA(3 mL)的1 mol/L的盐酸甲醇溶液,充分混匀,室温?#36335;?#24212;10 min,在640 nm处测吸光度,每个处理平行重复两次,结果以儿茶酚等价?#24403;?#31034;。儿茶酚标准曲线浓度为:125 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L和0 mg/L。红葡萄酒酒样稀释10倍;白葡萄酒样品不稀释。

1.2.2 SDS-PAGE研究葡萄酒中酚类物质与BSA的相互作用

选取4名无口腔疾病且不吸烟的志愿者,2男2女,上午10点~11点收集唾液,在收集之前1 h内不进食和饮料。将唾液收集到离心管中,静置过夜后在4000 r/min条件下离心10 min,除去不溶物质,所得上清液为唾液蛋白样品[19]。

在25 ℃条件下样?#37210;?#21822;液结合,反应10 min之后,用离心机在4000 r/min条件下离心10 min,取上清液,样品缓冲液(0.6 mL 的1 mol/L、pH 6.8 Tris-HCl,5 mL、50%甘油,2 mL、10% SDS,0.5 mL β-巯基乙醇,1 mL、1%溴酚蓝,0.9 mL蒸馏水)与上清液以1:4的比例混合,并用?#20852;?#29038;沸5 min,放入-20 ℃保存待用。使用12%丙烯酰胺分离胶和5%丙烯酰胺浓缩胶进行分析。开?#20339;?#25321;电压100 V,电流65 mA,待条带跑过浓缩胶区域,将电压调至120 V,电流72 mA,等条带跑至分离胶底部?#20445;?#20572;止电泳。将凝胶从玻璃板上剥下,用考马斯亮蓝 R250(45%甲醇和10%冰乙酸)染色,再用脱色液(100 mL甲醇,100 mL冰乙酸,定容1000 mL)脱色[20~22]。之后把凝胶放置于凝胶成像仪上进行拍照,保存?#35745;?#23558;成像结果用化学发光成像仪的成像软件对条带的光密度进行分析。记录光密度值。记录与样品结合后的蛋白条带(55 ku左右)的光密度值,计算与唾液蛋白光密度对比后降低的百分比,这个比?#31291;图?#24405;为SPI值(唾液沉降指数)。

1.2.3 光谱法研究葡萄酒中酚类物质与 BSA的相互作用

荧光光谱测定:分别取200 μL葡萄酒工作液与3 mL BSA工作液,室温?#36335;?#24212;5 min。以相同浓度的BSA溶液作空白,?#28525;?#28608;发波长EX=280 nm,激发狭缝宽度为5 nm,发射狭缝宽度为10 nm,发射波长在285~450 nm范围内扫描BSA的荧光光谱及BSA与不同品种葡萄酒、不同聚合度葡萄酒的荧光光谱,实验设定温度分别为25 ℃[23,24]。

1.3 数据处理


采用UVP VisionWorksTM LS(光密度分析软件)、Excel 2010与DPS 7.05(DPS数据处理?#20302;常?#36827;行各因子的数据分析与Duncan’s差异显著性分析。

2 结果

2.1 总酚和总黄烷醇的测定


从表1中可以看出,不同品种葡萄酒及其组分的总酚含量存在显著差异。8个样品的总酚含量在1626~2631 mg/L GAE(没食子当量)之间,其中单体酚总酚含量为160~252 mg/L GAE,低聚物总酚含量为346~497 mg/L GAE,高聚物总酚含量为407~963 mg/L GAE。结合表中数据分析可知,每个品种的不同聚合度组分的总酚含量的高低?#25215;?#34920;现为:高聚物>低聚物>单体酚,且葡萄酒的总酚含量高?#20445;?#20854;不同聚合度组分的总酚含量不一定也高。

表1 葡萄酒及其组分的总酚含量
Table 1 Total phenolic contents of different wines and its components with different degrees of polymerization

注:表内不同字母为差异达显著水平(p<0.05)。

样品 总酚含量[TPC (mg/L GAE)]酒 单体酚 低聚 高聚R1(莫高干红葡萄酒) 1939±73.31bc 229±7.33b 346±10.72e 407±13.63f R2(长城干红葡萄酒) 1954±93.22bc 200±0.41c 441±4.30b 758±0.83b R3(师原赤霞珠干红葡萄酒) 2249±93.68ab 172±6.75e 410±10.08c 766±18.64b R4(赤霞珠单品种葡萄酒) 2631±42.43a 180±3.97d 497±11.98a 963±10.72a R5(蛇龙珠单品种葡萄酒) 1626±49.50e 174±3.53de 377±6.75d 550±4.59d R6(美乐单品种葡萄酒) 2076±7.07c 205±2.58c 410±12.62c 618±9.29c R7(佳美单品种葡萄酒) 2181±155.56b 252±2.58a 425±10.75bc 602±14.31c R8(神索单品种葡萄酒) 1741±56.57d 160±3.59f 374±2.58d 488±5.02e

表2 葡萄酒及其组分的总黄烷醇含量
Table 2 Total flavanols contents of different wines and its components with different degrees of polymerization

注:表内不同字母为差异达显著水平(p<0.05)。

样品 总黄烷醇含量[TFA (mg/L CTE)]酒 单体酚 低聚 高聚R1 895.39±12.82bc 112.87±1.29c 244.47±5.85de 272.91±26.01c R2 776.24±67.08bc 102.87±2.51d 286.45±21.34bc 376.88±82.87a R3 759.22±26.56bc 78.40±10.88f 281.63±2.83bc 303.97±26.10ab R4 1015.8±136.89ab 107.48±3.46cd 329.00±20.43a 341.13±41.52a R5 624.74±29.92e 92.38±1.77e 241.35±12.34e 207.23±22.30e R6 952.31±7.07b 127.69±1.61b 302.62±22.37b 259.72±51.98d R7 1108.8±6.35a 169.61±5.22a 268.30±5.31cd 211.20±24.58e R8 601.67±89.75c 80.18±2.78f 199.22±5.13f 270.35±25.10c

结果显示(表2),不同品种葡萄酒及其组分的总黄烷醇含量存在显著差异,且葡萄酒总黄烷醇含量总体上低于总酚含量。8种葡萄酒总黄烷醇的含量在601~1108 mg/L CTE(儿茶素当量)之间,其中单体酚为78~169 mg/L CTE,低聚物为199~329 mg/L CTE,高聚物为207~376 mg/L CTE。每个品种的不同聚合度组分的总黄烷醇含量的高低?#25215;?#34920;现为:高聚物>低聚物>单体酚。

2.2 SDS-PAGE与SPI指数评价葡萄酒中酚类物质与BSA的相互作用


图1 唾液与葡萄酒及与各聚合度组分相互结合的SDS-PAGE
Fig.1 The SDS-PAGE of supernatant that formed by binding reactions amongest saliva, different wines and its components with different degrees of polymerization

注:a,b:唾液与不同品种葡萄?#33889;?#20114;结合的SDS-PAGE和光密度值;c,d:R3不同聚合度组分与BSA作用的SDS-PAGE和光密度值;e,f:R6不同聚合度组分与BSA作用的SDS-PAGE和光密度值。MW,左边标记的为分子量。

表3 不同品种葡萄酒及其组分的SPI值
Table 3 The SPI values of different wines and and its components with different degrees of polymerization

注:表内不同字母为差异达显著水平(p<0.05)。

样品 SPI值(光密度降低百分比/%)酒 单体酚 低聚 高聚R1 52.39±2.84e 33.88±0.53d 26.00±0.92ef 44.38±1.83e R2 59.15±1.66d 25.89±0.81f 23.96±1.09f 36.08±1.23f R3 86.35±3.41a 28.91±0.42e 29.97±0.64d 67.73±1.18b R4 91.50±0.63a 57.03±1.04a 68.35±2.95a 98.85±1.77a R5 41.42±1.80g 40.70±0.75b 29.28±1.02d 67.66±0.63b R6 83.73±0.60b 42.80±1.29b 45.20±0.66b 45.71±1.48d R7 73.74±2.33c 38.65±0.55c 41.67±1.02c 63.31±1.56c R8 47.63±1.03f 24.16±0.63f 27.19±0.34e 43.18±1.18e

唾液与8种不同葡萄酒在2:1比例条件下结合,并取上清液进行SDS-PAGE,电泳条带图如图2A所示。可以观察到不同品种葡萄酒与唾液蛋白相互作用的强度不同,即表明各品种葡萄酒中的酚类物质含量不同,产生的涩感亦有差异。根据光密度值,可以计算出各品种葡萄酒与唾液结合后,使唾液蛋白光密度?#23548;?#23569;的百分比,即SPI值,进而得出葡萄酒酚类物质沉降唾液蛋白的能力大小。SPI值大的品种对应沉降蛋白的能力就越强,反之,SPI值越小?#27169;?#20854;沉降蛋白的能力就越弱。

由图1和表3可以看出,8种葡萄酒中R5和R8的SPI?#21040;?#23567;,R3和R4较大,即R4和R3沉降唾液蛋白的能力较强,R5和R8较弱。这个结果与总酚含量的测定结果(表1)相一致。8个样品不同聚合度组分中都是高聚物的SPI值最高,即其结合唾液蛋白的能力最强;R3、R4、R6、R7和R8这五个品种的单体酚与唾液蛋白结合后的SPI值低于低聚物,即与唾液蛋白结合作用的能力弱于低聚物;R1、R2和R5这三个品种葡萄酒的单体酚类物质结合蛋白后的光密度值高于低聚物,即表明他们的单体酚类物质结合蛋白的能力较其低聚物强。

2.3 光谱法研究葡萄酒中酚类物质与 BSA的相互作用


图2 葡萄酒与BSA作用的荧光光谱图
Fig.2 Fluorescence spectra of the interactions amongst wines and BSA

单一体系的牛血清蛋白与多酚提取液反应 5 min后进行荧光光谱测定,结果如图2所示。8种不同品种葡萄酒对BSA荧光猝灭作用有强有?#37232;?#20294;差异不甚明显,葡萄酒的不同聚合度组分对BSA的猝灭作用有显著差异。BSA峰值一定,样品的峰值越高,表示物质对BSA的猝灭作用就越?#37232;?#21453;之,峰值?#38477;停?#21017;表示物质对BSA的猝灭作用越强。与葡萄酒样品作用的BSA的峰值为734.65 nm,8种酒中R6和R7的峰?#21040;?#39640;为347.76 nm、347.98 nm,R4的峰?#21040;?#20302;为257.61 nm,表明R6和R7对BSA的淬灭作用较?#37232;琑4对BSA的淬灭作用较强。与葡萄酒不同聚合度组分作用的BSA峰值为541.68 nm,8种葡萄酒的3种组分高聚物的峰值最低,表明高聚物对 BSA的淬灭作用最强;R1、R2、R3和R6的单体酚峰值低于低聚物,表明这几种酒的单体酚对BSA的淬灭作用强于低聚物;R4、R5、R7和R8的单体酚峰值高于低聚物,表明这几种酒的单体酚对BSA的淬灭作用弱于低聚物。

3 ?#33268;?/h2>
3.1 多酚是葡萄酒中最重要的涩感物质。葡萄品种、酿酒工艺和地理环境等因素都会造成葡萄酒中酚类物质含量及种类的差异,进而导致葡萄酒涩感的差异[7,8]。酚类物质除影响葡萄酒涩感以外,对葡萄酒的色泽、香气和抗氧化等性质也有一定影响。本实验测定的8种红葡萄酒的总酚含量在1626~2631 mg/L GAE(没食子当量)之间、总黄烷醇含量在601~1108 mg/L CTE(儿茶素当量)之间。被测的葡萄酒涩感存在显著的差异,其中R4和R7涩感较强,R5和R8涩感较?#37232;?#32780;R1、R2、R3及R6的涩感强弱居中。根据品品鉴结果:赤霞珠品种葡萄酒涩感较强,蛇龙珠和神索葡萄酒涩感较?#37232;?#20960;种酒之间色泽、香气和口感等都有一定的差异。因此,葡萄酒中酚类物质的种类和含量直接影响着葡萄酒的涩感,也在一定程度上影响着葡萄酒的色泽及香气等其他品质。

3.2 葡萄酒中的酚类物质结构复杂、种类繁多,大多以化合态或聚合态存在,而酚类物质的聚合度与涩感之间的关系是一个关键问题。?#34892;?#33889;萄酒即使总酚含量相近,涩感却相去甚远。马锦锦[25]和孙云[26]等人分别测定葡萄酒,葡萄皮、籽的聚合度,其结果表明不同葡萄酒,葡萄皮、籽的平均聚合度各不同。葡萄皮、籽中酚类物质及其聚合度不同,浸入酒中的酚类物质及其聚合度也不相同,因而葡萄酒中单体酚、低聚合度多酚、高聚合度多酚的含量不同,而不同聚合度的多酚对涩感的影响不同。本研究根据不同的原理,采用多种方法测定葡萄酒中不同聚合度的酚类物质对涩感的影响。其中高聚物的总酚、总黄烷醇含量最高,能沉淀最多的唾液蛋白,对牛血清蛋白的影响最强,因此可以确定高聚物对葡萄酒涩感的影响最,而单体酚与低聚物对涩感的影响则因葡萄酒品种的不同而不同。

3.3 葡萄酒涩感的产生是由于多酚和蛋白的相互作用,而这种相互作用会导致多酚与蛋白质的结构、功能和特?#33489;?#29983;变化。感官评价是评价涩感较好的方法,但受到的影响因素较多,因此在许多研究中都需采用非感官的体外评价方法。而非感官的评价方法大多是在多酚/蛋白相互作用的基础进行的[27],多酚/蛋白的相互作用主要通过3种方式来进行研究:通过多酚来沉淀蛋白质;研究蛋白质与多酚形成的复合物;研究多酚与蛋白质相互作用对蛋白质造成的影响[28]。由于蛋白质/多酚的相互作用较为复杂,没有单一的技术能提供全面的信息,一般通过多种方法进行检测。Baoshan Sun[20]、 Raúl Ferrer-Gallego[23]和 Bernd Schwarz等[1]利用SDS-PAGE、荧光光谱与HPLC等方法在多酚/蛋白相互作用的基础上研究酚类物质与涩感的关系。本研究结合SDS-PAGE与荧光光谱法来检测葡萄酒及其不同组分与蛋白质的相互作用。在SDS-PAGE实验中:R4和R3沉降唾液蛋白的能力较强,R5和R8较?#37232;?#39640;聚物能沉淀最多的唾液蛋白,单体酚与低聚物沉淀蛋白的能力在不同的葡萄酒中表现不同。在荧光光谱实验中:R4对BSA的淬灭作用较强,R6和R7较?#37232;?#39640;聚物对蛋白质的作用最强,单体酚和低聚物较弱。总而言之,红葡萄酒中的高聚物对蛋白质的影响最强;而单体酚和低聚物则因酒而异。

4 结论


不同葡萄酒中酚类物质的种类和含量存在显著差异。赤霞珠品种葡萄酒中酚类物质含量较高,蛇龙珠、神索品种葡萄酒中酚类物质含量较低。不同的酚类物质与蛋白质相互作用的强度不同:高聚物结合蛋白的能力最强,单体酚和低聚物作用于蛋白质的能力在不同的葡萄酒中表现不同。


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Effects of Polyphenols on the Wine Astringency by Phenolic/Protein Interaction Model

ZHU Yan-yun1, WANG Xiao-yu1, DU Guo-rong2, TIAN Cheng-rui1, WANG Xue-hui1, REN Meng-meng1,ZHANG Juan1
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)(2.School of Biological and Environmental Engineering, Xi'an University, Xi’an 710065, China)


Abstract: The difference of the interaction between phenolic compounds and protein with diverse polymerization degrees in different red wines was investigated to find out the key components of astringency for improving the wine-making process and selecting grape varieties.Using the different varieties of red wines as material, the phenolic substances of wine were divided into three parts by C18 solid phase extraction column: monophenols, oligomers and polymers. The contents of total phenols and total flavanols were determined. The interactions of different phenolics and protein were investigated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and fluorescent spectrometry. There were significant differences in total phenols and total flavanols contents in red wines. The contents of total phenols and total flavanols of phenolic fragments with different degrees of polymerization in red wines were as follows: monophenols < oligomer < polymer. The results of SDS-PAGE and fluorescence spectrometry showed that the effect of high polymers on the protein was the strongest, and the effects of monophenols and oligomers in different wines on the protein presented variance. The composition with different degrees of polymerization in the wine had different effects on the wine astringency. In the process of selecting grape varieties and improving the wine-making process, the control of the phenolic substance could be considered, especially for the regulation of the polymer.


Key words: wine; phenolic compounds; polyphenol/protein interaction; astringency


文章篇号:1673-9078(2017)11-63-69


DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.11.010


收稿日期:2017-06-20


基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(31301526);西安?#20449;?#19994;技术研发项目[NC1503(5)]


作者简介:朱艳云(1994-),女,在读硕士,研究方向:农产品加工


通讯作者?#21644;?#26195;宇(1979-),男,博士,副教授,研究方向:食品加工


本文地址:http://www.erwyyv.tw/wine/19057.html 转载自超星期刊
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